奶牛乳腺炎是奶牛四大疾病之一, 其造成的经济损失仅次于不孕症而高于肢蹄病和代谢病。美国每年因奶牛乳腺炎造成的损失达20亿美元, 我国也超过了3.16亿元。导致奶牛发生乳腺炎的主要病原为葡萄球菌属、链球菌属和一些G-菌。世界各国对乳房炎进行了广泛的研究, 主要集中在病原菌的分离鉴定及治疗上。近几年来, 奶牛乳腺炎的发病机理和诊断技术逐渐成为人们关注的焦点。奶牛乳腺疾病主要起源于乳腺各级导管和腺泡上皮的变化。体外培养的原代乳腺上皮细胞具有二倍体遗传特性, 最能反映和接近体内生长状况, 并具有乳腺细胞的一些功能。建立原代乳腺上皮细胞培养方法, 利用体外模型研究病原菌及其毒力成分与乳腺上皮细胞相互作用的机理, 从细胞水平上阐述其致病原因已成为迫切需要。该试验拟对奶牛乳腺上皮细胞原代培养方法进行探讨, 旨在为上述研究奠定基础, 并为人类乳腺癌的研究提供动物细胞模型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 乳腺组织。从屠宰场选取健康的泌乳期奶牛, 无菌手术切取乳腺实质组织, 置于DMEM/F12完全培养液 (含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU /ml链霉素) 中, 尽快运回实验室。1.1.2 主要试剂。DMEM/F12 (美国Gibco公司) 、胎牛血清 (TBD公司) 、胰蛋白酶 (Trypsin, 1∶250) (美国Gibco公司) 、青霉素100 IU/ml、链霉素100 IU/ml等, 配制后采用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌;鼠抗人细胞角蛋白14、18单克隆抗体 (Sigma公司) 、兔/鼠通用型SA-HRP试剂盒 (北京康为世纪生物科技有限公司) , 丙酮等其他试剂为国产分析纯。按要求4 ℃或-20 ℃保存备用。1.1.3 主要仪器。HPS-250生化培养箱 (哈尔滨市东明医疗仪器厂) , IX71倒置相差显微镜 (OLYMPUS, 日本) , Axiovert 200M显微操作仪 (ZEISS, 德国) , 普通显微镜 (Nikon) , 恒温水浴锅 (山西省文水医疗器械厂) 。